線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品英文名:  Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅣActivity Assay Kit

產(chǎn)品貨號(hào)：BC0940                產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷8三樓

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣           產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            參考價(jià)格：1900
庫(kù)存狀態(tài)：現(xiàn)貨                          
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簡(jiǎn)要介紹：
線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅳ又稱(chēng)細(xì)胞色素C 氧化酶，也是線(xiàn)粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C 的氧化，并終把電子傳遞給氧，生成水。
    還原型細(xì)胞色素C 在550nm 有特征光吸收，線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C 生成氧化型細(xì)胞色素C，因此550nm 光吸收下降速率能夠反映線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。

產(chǎn)品詳細(xì)描述
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體80mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體21mL×2瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×2支，-20℃保存；
試劑三：粉劑×2支，4℃保存；
工作液的配制：臨用前取試劑一、試劑二、試劑三各一支，將試劑二和試劑三依次轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解。
 
產(chǎn)品說(shuō)明：
線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅳ又稱(chēng)細(xì)胞色素C氧化酶，也是線(xiàn)粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C的氧化，并終把電子傳遞給氧生成水。還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收，線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C 生成氧化型細(xì)胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。
試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、復(fù)合體Ⅳ的提取：   

• 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
• 4 ℃ 600 g離心10min。
• 將上清液移另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心15min。
• 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線(xiàn)粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做，可以判斷線(xiàn)粒體提取效果）。
• 在沉淀中加入400uL提取液，超聲波破碎（功率20％，超聲5秒，間隔10秒，重復(fù)15次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測(cè)定，并且用于蛋白含量測(cè)定。

二、測(cè)定步驟：

1. 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)550nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 樣本測(cè)定
3. 將工作液置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育15min；用不完的試劑4℃可保存一周；
4. 在1mL玻璃比色皿中分別加入

立即混勻，分別記錄測(cè)定管和空白管550nm處初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2，測(cè)定管的記為A1測(cè)定管，A2測(cè)定管，空白管的記為A1空白管，A2空白管。計(jì)算ΔA1=A1測(cè)定管-A2測(cè)定管，ΔA2=A1空白管-A2空白管，ΔA=ΔA1-ΔA2。
三、復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算：
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr
V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4 L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL； T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需自行測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過(guò)高（高于1），可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），使A1-A2 小于0.2，可提高檢測(cè)靈敏度；若ΔA偏小，則可以通過(guò)增加加入的樣品體積來(lái)提高靈敏度。
2. 由于提取液中含有蛋白，所以在測(cè)定樣品蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨(dú)測(cè)量）。
3. 本試劑盒試劑足夠完成50管反應(yīng)。
4. 附：使用樣本重量計(jì)算公式：（檢測(cè)樣本數(shù)為50T/24S）

A、上清中復(fù)合體Ⅳ活力的計(jì)算：
按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/g)=[ΔA1×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1099×ΔA1÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4 L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V提取：加入提取液體積，1.0mL。 w：樣本重量，g。T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；
B、沉淀中復(fù)合體Ⅳ活力的計(jì)算：
按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/g)=[ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=440×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀測(cè)定值；V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4 L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V提取：加入提取液體積，0.4mL。 w：樣本重量，g。T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；
C、樣本復(fù)合體Ⅳ總活力的計(jì)算：
樣本復(fù)合體Ⅳ總活力即為上清中復(fù)合體Ⅳ活力與沉淀中復(fù)合體Ⅳ活力之和。
按樣本鮮重計(jì)算：
復(fù)合體Ⅳ（U/g）=1099×ΔA1÷W+440×ΔA2÷W

相關(guān)文獻(xiàn)：
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